间充质干细胞(MSCs)通过其分泌因子(称为分泌组)具有免疫调节特性和对自身免疫性疾病的治疗作用。然而，间充质干细胞分泌组的具体关键因子及其在免疫细胞中的作用机制尚未完全确定。大多数体外实验都是使用免疫细胞进行的，但使用自然杀伤细胞(NK)的实验被忽视，并且使用NK细胞的一些研究显示结果存在差异。NK细胞是免疫系统的重要组成部分，调节其活性对控制各种病理状况至关重要。本研究的目的是阐明脂肪组织源性干细胞(ADSC)分泌组对NK细胞活性的作用。
为了获得ADSC分泌组，我们在培养基中培养ADSC，并使用切向流过滤(TFF)胶囊浓缩培养基。我们分别使用CCK-8和CFSE检测来评估NK细胞的活力和增殖。我们利用流式细胞术、ELISA、细胞毒性试验、CD107a试验、western blotting和实时荧光定量PCR分析了ADSC分泌组对NK细胞活性和通路相关蛋白的影响。为了确定ADSC分泌组的组成，我们进行了LC-MS /MS分析和生物信息学分析。为了阐明所涉及的分子机制，我们使用mRNA测序来分析人类血液NK细胞的转录表达。
发现ADSC分泌组在保持增殖能力的同时限制NK细胞il -2介导的效应功能。这种作用是通过上调抑制受体CD96，以及下调激活受体和IL-2受体亚基IL-2Rα和IL-2Rγ来实现的。这些变化与NK细胞中JAK-STAT和AKT通路的减弱有关，这是通过细胞因子诱导的含sh2蛋白(CIS，由Cish编码)和双特异性蛋白磷酸酶4 (DUSP4)的上调实现的。此外，蛋白质组学分析揭示了12个与MSCs免疫调节作用相关的新候选蛋白。
我们的研究结果揭示了ADSC分泌组对NK细胞活性的详细细胞结果和调节机制，并提出了使用MSC分泌组治疗NK介导的炎症和自身免疫性疾病的治疗工具。
自然杀伤细胞(NK)是一种大颗粒淋巴细胞，在没有事先致敏的情况下，通过胞吐分泌细胞毒性颗粒，如穿孔素和颗粒酶B，诱导靶细胞凋亡[1]。此外，它们快速分泌多种细胞因子和趋化因子，如IFN-γ、GM-CSF、IL-10、TNF-α、CCL3-5等，通过多种机制诱导或放大炎症反应[2,3]。NK细胞的激活主要由激活和抑制表面受体之间的严格结合和平衡控制，这些表面受体通过其细胞质尾部的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAMs)或抑制基序(ITIMs)转导每种信号[4,5]，并通过整合来自细胞因子的信号，如IL-2、IL-12、IL-15和IL-18[6,7]。激活受体识别病原体来源或应激诱导的配体，诱导细胞因子分泌和细胞毒性杀死靶细胞。相反，抑制性受体识别存在于健康宿主细胞上的主要组织相容性复合体(MHC) I类，从而保护健康细胞免受NK细胞介导的杀伤[8,9]。
当携带ITIMs的NK抑制受体与其配体结合时，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)如含有Src同源2 (SH2)结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP-1和SHP-2)和含有SH2结构域的肌醇磷酸酶(SHIP-1和SHIP-2)会聚集，它们会使与激活信号相关的信号蛋白去磷酸化，从而抑制NK细胞反应[5,10]。此外，这些PTPs还调节细胞因子介导的Janus激酶(JAK)-信号转导和转录激活因子(STAT)途径以及细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)蛋白，这些蛋白作为负反馈回路，由细胞因子诱导阻断进一步的信号转导[11,12]。它们通过泛素化作用使靶蛋白(酪氨酸磷酸化的jak或STATs)发生蛋白酶体降解[13]。降低NK细胞活性可能导致对感染和癌症的易感性增加，而过度NK细胞活性可能会导致严重的组织损伤[14,15]。尽管调节NK细胞活性对于控制各种病理状况至关重要，但调节NK细胞活性功能结果的基本内源性机制仍有待研究。
间充质干细胞(MSCs)具有多种生物学特性，这取决于其细胞微环境，它们促进组织再生和免疫调节[16]。许多研究人员专注于利用它们的治疗能力来治疗退行性和炎症性疾病。目前公认的是，间充质干细胞的免疫调节特性是由于其分泌因子(统称为分泌组)以旁分泌方式而不是细胞本身的作用[17,18,19]。目前的注意力已经转移到临床应用的基于分泌体的治疗，因为它可以被认为是基于细胞的治疗的一种替代方法[20,21,22]。
间充质干细胞分泌组由多种分子组成，如细胞因子、趋化因子、核酸、生长因子、蛋白酶、微囊泡、外泌体和免疫调节因子。这种间充质干细胞分泌组的组成可以通过一些策略来改善治疗效果，例如使用生物刺激启动和通过转染或转导进行基因修饰[19,21]。MSC分泌组通过其免疫调节、抗炎、抗凋亡和促血管生成特性而具有治疗益处[23,24]。既往研究报道，间充质干细胞分泌组含有多种生物活性因子，能够调节包括NK细胞在内的免疫细胞的增殖、分化和效应功能，从而在炎症和自身免疫性疾病中发挥治疗作用[25,26]。
因此，越来越多的证据表明，通过常用的技术，包括用于临床应用的蛋白质组学分析，MSC分泌组中具有治疗潜力的精确组成[27,28,29,30,31,32,33,34,35,36]。然而，大量研究并没有完全阐明MSC分泌组在免疫细胞或组织中介导结果的特定关键因子，这表明很难准确确定MSC分泌组中哪些因子负责免疫调节[19]。因此，研究准确表征msc分泌因子，确定分泌组中负责免疫调节的主要因子及其作用机制，对于开发利用干细胞的先进疗法至关重要[37]。为了达到这一点，大多数体外实验使用T细胞、B细胞和巨噬细胞，但只有少数使用自然杀伤细胞(NK)[38]。迄今为止，即使是少数关于msc衍生的可溶性因子对NK细胞的影响的研究也显示出差异[39,40,41,42,43]。因此，有必要阐明MSC分泌组如何影响NK细胞，以及这些作用背后的精确分子机制。
为了解决这些问题，我们利用人类NK细胞系和血源性NK细胞，在整体细胞现象和细胞内信号分子表达变化的背景下，研究了分泌组效应的几个方面。在这项研究中，我们证明了来自人脂肪组织源性干细胞(ADSCs)的分泌组通过上调抑制受体CD96以及下调激活受体和一些IL-2受体亚基来抑制NK细胞IL-2介导的效应功能，包括细胞因子的产生和靶细胞的杀伤，但不影响细胞增殖。我们还发现，与il -2介导的信号通路相关的负调节因子CIS和磷酸酶DUSP4被ADSC分泌组上调，并确定了与MSCs免疫调节相关的新的候选物质。综上所述，我们的研究结果提出了一个详细的功能和基于机制的观点，即通过ADSC分泌组调节NK细胞活性，支持使用MSC分泌组治疗NK介导的炎症和自身免疫性疾病的治疗工具。
所有细胞系由延世大学医学院金钟善教授提供。将人NK细胞系NK-92细胞培养在完全生长培养基中，如ATCC产品说明书(CRL-2407;ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)。用α最小基本培养基(α- mem;Gibco, Grand Island, NY, USA)补充0.2 mM肌醇(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)， 0.1 mM 2-巯基乙醇(Gibco)， 0.02 mM叶酸(Sigma-Aldrich)， 1%青霉素/链霉素(Gibco)， 12.5%热灭活胎牛血清(FBS);康宁公司，康宁，NY, USA)， 12.5%热灭活马血清(Gibco)和重组人(rh) IL-2 (5 ng/ml);NKMAX有限公司，城南，大韩民国)，细胞存活和激活所必需的。K562是一株人骨髓性白血病细胞系，培养于rpm -1640培养基(康宁公司)，培养基中添加10%牛血清(康宁公司)、1%非必需氨基酸(Gibco公司)、2% HEPES(康宁公司)、1%丙酮酸钠(康宁公司)、55 μM 2-巯基乙醇(Gibco公司)、0.2%庆大霉素(Gibco公司)和1%青霉素/霉素(Gibco公司)。细胞保存在37℃、5% CO2的细胞培养箱中。
之所以使用来自脂肪组织的间充质干细胞，是因为与骨髓、脐带和胎盘等其他组织相比，它们相对容易获得，并且具有适用于自体移植的优点。人ADSCs (PromoCell, Heidelberg, Germany)在低糖Dulbecco 's modified Eagle 's培养基(DMEM;康宁公司)补充10%牛血清(康宁公司)、1%非必需氨基酸(Gibco)和1%青霉素/链霉素(Gibco) 5 - 6代。为了获得ADSC分泌组，在无血清的条件下，用不含酚红的低糖DMEM (Gibco)代替培养基，添加2 mM l -谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)和1%青霉素/链霉素(Gibco)。使用人类NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，威斯特伐利亚，德国)，根据制造商的说明，从阴性选择的健康供者的人外周血单个核细胞(PBMCs)中分离人原代NK细胞。所有方案均经延世大学Severance医院机构审查委员会(IRB号:4-2020-1062;批准日期:2020年11月9日)，并在向健康供体充分解释研究的性质和可能的后果后获得知情同意。分离后，将纯度> 90%的纯化NK细胞立即在含10 ng/mL rhIL-2的α- mems完全生长培养基中培养，使其存活和活化。细胞保存在37℃、5% CO2的细胞培养箱中。
将传代5或6 (P5或P6)的ADSCs按2 × 105个/板的密度分装于100个10-cm培养皿(康宁公司)中，在细胞培养箱中37℃、5% CO2条件下与生长培养基孵育，扩增至90%以上合度。孵育后，用Dulbecco 's phosphate-buffered saline (DPBS)洗涤ADSCs 2次，去除血清和酚红，用不含fbs的培养基替代生成分泌组，孵育48 h。之后，收集ADSCs中不含血清和酚红的条件培养基1 L, 1800 - 2000 rpm离心5 min，去除细胞碎片或死细胞。根据制造商的说明，使用切向流过滤(TFF)胶囊(Pall Corporation, New York, NY, USA)对该介质进行超滤浓缩，该胶囊含有3 kda分子量截止(MWCO)膜。随后，使用BCA蛋白测定法(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)分析ADSC分泌组，以估计蛋白浓度，并立即保存在- 80°C。通过筛选NK-92细胞IFN-γ分泌水平，验证了本研究使用的所有分泌组的有效性。
为了维持细胞，将NK-92细胞在T-25培养瓶(Thermo Fisher Scientific)中以7 × 104个细胞/mL的完全培养基中，加入5或10 ng/mL的rhIL-2 (NKMAX Co . Ltd.)，终体积为5 - 15 mL，根据细胞密度每2-3天更换一次培养基。由于NK-92细胞对过度生长和IL-2耗损高度敏感，因此严格遵循这种传代培养程序。在ADSC分泌组研究中，NK-92细胞以1 × 105个/mL、最终体积为2 mL的速度接种到6孔培养板(康宁公司)中，并使用rhIL-2 (5 ng/mL;NKMAX有限公司)。对于人原代细胞，从健康供者的血液中分离出来后，将NK细胞以1 × 106个/mL的密度在生长培养基中进行接种，并在24孔培养板(康宁公司)中添加或不添加10 ng/mL的rhIL-2 (NKMAX有限公司)。
根据制造商的说明，使用CCK-8检测试剂盒(Sigma-Aldrich)测量细胞活力。简单地说，将1 × 104个NK-92细胞接种于含有100 μL培养基的96孔平板(SPL Life Sciences, Pocheon, Republic of Korea)中，为保证结果的准确性，一式三次，在加或不加ADSC分泌组的情况下孵育48 h。然后，在每孔中加入10 μL CCK-8试剂，在37℃下孵育4 h。最后，使用酶标仪(Molecular Devices, San Jose, Ca, USA)在450 nm处测量吸光度。
用羧基荧光素二醋酸琥珀酰酰酯(CFSE)测定细胞增殖;eBioscience, San Diego, CA, USA)，根据制造商的协议。简单地说，用1 μM的CFSE标记NK-92细胞，然后用不同浓度的ADSC分泌组在24孔板(康宁公司)中以1 × 105个/mL的浓度培养48或96 h。细胞在BD FACSVerse仪器(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)上分析，数据使用FlowJo v10软件(FlowJo LLC, Ashland, OR, USA)分析。
利用ELISA试剂盒(BD Biosciences;研发系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国;Mabtech AB, Nacka Strand, Sweden)，根据制造商的说明。在450和570 nm处用酶联免疫吸附测定仪(Molecular Devices)测定吸光度。
使用Calcein-AM释放法(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)测量NK细胞对靶细胞的细胞溶解能力。简单地说，用1 μM calcein-AM在37℃下对K562靶细胞进行10分钟的染色，用PBS洗涤两次，然后在RPMI完全培养液中重悬。然后，将100 μL培养基中的靶细胞(1 × 104)分四次接种到圆底96孔板(Thermo Fisher Scientific)中，与100 μL适当浓度的NK细胞孵育3-4 h，获得效应靶比(E:T)。用Varioskan Flash荧光计(ex/em=494/517 nm)测定K562靶细胞裂解释放的含有钙黄素am的共培养上清;赛默飞世尔科技公司)。NK细胞引起的特异性裂解百分比按下式计算:
其中，加入Triton X-100(终浓度为2%)时达到最大释放;Sigma-Aldrich)。
用pe偶联CD107a检测NK细胞脱颗粒。将经ADSC分泌组或不经ADSC分泌组预处理48 h的NK细胞接种于含2 × 104 K562靶细胞的圆底96孔板(Thermo Fisher Scientific)中，最终体积为200 μL，与PE-anti-CD107a抗体(BD Biosciences)以1:20的最终稀释比例在37℃下孵育1 h。此后，GolgiPlug(1000倍稀释;将含有抑制细胞内蛋白转运的brefeldin A的BD Biosciences)添加到每个孔板中，孵育2-3小时，然后用pe - cy7偶联CD56单克隆抗体在4℃下染色30分钟。使用BD LSRFortessa X-20仪器(BD Biosciences)分析NK细胞中CD107a的表达，使用FlowJo v10软件(FlowJo LLC)分析数据。
对于表面抗原，用适当的单克隆抗体(mab)在4°C下染色30分钟，并用添加5% FBS的PBS洗涤。对于细胞内抗原，细胞悬液与phorbol 12-肉豆酸酯13-乙酸酯(PMA)预孵育;50 ng / mL;Sigma-Aldrich)，离子霉素(750 ng/mL;Sigma-Aldrich)和GolgiPlug (1 μg/mL;BD Biosciences)处理4小时。随后，从体外培养中收集细胞，并对所指示的标记物进行表面染色。将细胞用细胞内(IC)固定缓冲液(eBioscience)在18°C至25°C下固定20分钟，并用渗透性缓冲液(eBioscience)渗透后，使用合适的单克隆抗体在18°C至25°C下进行45分钟的细胞内细胞因子染色。使用BD LSRFortessa X-20仪器(BD Biosciences)收集数据，并使用FlowJo v10软件(FlowJo LLC)进行分析。使用针对人的荧光团共轭单抗。BV421-CD56 (HCD56)、FITC-CD56 (HCD56)、FITC-CD3 (HIT3a)、PE-CD56 (HCD56)、PE-NKp46 (9E2)、PE-CD96 (NK92.39)、PE-TIGIT (A15153G)、PE-CD94 (DX22)、PE-Tim-3 (F38-2E2)、PE-IL-10 (JES3-19F1)、pe -颗粒酶B (QA16A02)、BV711-CD56 (HCD56)、BV711-NKp30 (P30-15)、BV711-IFN-γ (4S.B3)、BV711-perforin (dG9)、PE-Cy7-CD16 (3G8)、PE-Cy7-CD25 (BC96)。PE-CD107a (H4A3)、PE-CD122 (Mik-β2)、BV711-NKG2D (1D11)、BV711-CD132 (AG184)和PE-Cy7-CD56 (B159)购自BD Biosciences。所有荧光团偶联单抗按1:100或1:200稀释。中和抗体，抗anxa1、抗dkk3、抗lgals3bp、抗pros1和抗pedf购自Abcam (Cambridge, UK)。
通过检测磷酸化蛋白和总蛋白来评估IL-2诱导NK细胞存活和活化的下游信号级联。收集NK细胞后，用PBS洗涤细胞两次以去除残留的培养基，然后在含有完整的微型蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche Diagnostics, Pleasanton, CA, USA)和PhosSTOP磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Roche Ciagnostics)的RIPA缓冲液(Biosesang, Seongnam, Republic of Korea)中裂解细胞，并在冰上均质。之后，细胞裂解液在4°C下以12,000 rpm离心15分钟以去除细胞碎片。蛋白浓度采用比辛胆酸(BCA)蛋白测定法(Thermo Fisher Scientific)测定。接下来，使用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离等量的细胞蛋白，然后转移到甲醇活化的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)。用阻断溶液(TransLab, Elgin, IL, USA)阻断后，在18°C至25°C下用一抗探测膜2小时。之后，在tris缓冲盐水中用TBS-T (TBS-T)洗涤6次，洗涤30分钟，然后在18°C至25°C下使用适合物种的辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗洗涤1小时。膜再次洗涤8次，持续40分钟，使用West-Q Pico ECL溶液(GenDEPOT, Katy, TX, USA)对蛋白质进行可视化，并使用Amersham ImageQuant 800生物分子成像仪(Cytiva, Marlborough, MA, USA)进行检测。使用ImageJ软件(NIH, Bethesda, MD, USA)和Multi Gauge V3.0软件(Fujifilm, Tokyo, Japan)定量免疫印迹条带的信号强度。western blotting采用一抗和二抗。JAK1 (D1T6W;1:1000稀释)，p-JAK1(cat。不。3331;1:1000)， jak3 (5h2;1:1000)， p-JAK3 (D44E3;1:1000)， p-STAT5 (C11C5;1:1000)， AKT (cat。不。9272;1:1000)， p-AKT (D9E;1:1000)， erk1/2 (137f5;1:1000)， p-ERK1/2 (D13.14.4E;1:2000)， cis (d4d9;1:500) dusp4 (d9a5;1:500)， shp1 (c14h6;1:1000)， p-SHP1 (D11G5;1:1000)， shp2 (d50f2;1:1000)， p-SHP2 (cat。不。3703;1:1000)， ship1 (d1163;1:500)， p-SHIP1 (cat。不。3941;1:500)，酶联小鼠IgG (cat;不。7076;1:2000)，酶联兔IgG (cat。不。7074;1:2000)购自Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)。DTX1(猫。不。HPA055275;1:500)，购自Atlas antibody (Bromma, Sweden)， STAT5 (cat。不。610191;1:20 00)购自BD Biosciences， β-Actin (C4;1:1000)购自Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)。
使用RNeasy Micro试剂盒(QIAGEN, Hilden, Germany)分离总RNA，并根据制造商的方案使用RT预混cDNA合成试剂盒(iNtRON-Biotechnology, Seongnam, Republic of Korea)转化为互补DNA (cDNA)。根据制造商的说明，使用StepOne Plus或Viia7系统(Applied Biosystems)和qPCRBIO SyGreen Mix (PCR Biosystems, London, UK)进行定量实时聚合酶链反应(qPCR)。扩增后立即进行熔化曲线分析以确认引物特异性。根据2?△△Ct计算方法，将相对RNA表达归一化为管家基因Gapdh信使RNA (mRNA)。所使用的引物如下:
Cish, 5 ' -GAACACACCAGCCACTGTCC-3 '(正向)和5 ' -GCCAGCAAAGGACGAGGTC-3 '(反向);Socs1, 5 ' -GTAGCACACAACCAGGTGGC-3 '(正向)和5 ' - ggaggaggaagaggagagg -3 '(反向);Socs2, 5 ' -TGCAAGGATAAGCGGACAGG-3 '(正向)和5 ' -CTGCAGAGATGGTGCTGACG-3 '(反向);Socs3, 5 ' - tttcgcttcccgggactagctc -3 '(正向)和5 ' -TTGCTGTGGGTGACCATGG-3 '(反向);dtx1,5 ' -CCTGTGAATGGTCTGGGCTTC-3 '(正向)和5 ' -CAGCGGCTGTGCTCATTCA-3 '(反向);dusp4,5 ' -CTGGACTGCAGACCGTTCCT-3 '(正向)和5 ' -GCCGCACGATGGTGTTACAG-3 '(反向);ptpn14,5 ' -GCAAGAAAGGACGGTGTGGC-3 '(正向)和5 ' -ACGGACCGACTGGATCTCCT-3 '(反向);Ptprf, 5 ' -GCGCTTCGAGGTCATTGAGT-3 '(正向)和5 ' - atggcttcatctcgctgca3 '(反向);Gapdh, 5 ' - cagcgaccacccactcctccacctt -3 '(正向)和5 ' -CATGAGGTCCACCACCCTGTTGCT-3 '(反向)。
使用ProteomTech Inc.(首尔，大韩民国)的蛋白质组学平台，对来自三个独立供体的三个分泌组进行了质量分析。用Braford蛋白测定法定量分泌组。此外，采用二维凝胶电泳(2-DE)进行蛋白质分离。采用考马斯亮蓝G-250染色法对蛋白进行可视化。使用Image Master 2D Platinum Software (Cytiva)对2-DE图像进行计算机分析。每个斑点的表达水平由每个斑点的体积除以凝胶中所有斑点的总体积来确定。图像分析后，将斑点进行凝胶内胰蛋白酶消化，并使用nanoACQUITY UPLC和LTQ Orbitrap XL质谱仪(Thermo Fisher Scientific)进行液相色谱串联质谱分析。使用SEQUEST软件(Thermo Fisher Scientific)处理单个MS/MS光谱，并使用MASCOT搜索程序(Matrix Sciences, Chicago, IL, USA)在NCBI数据库中进行检索。数据分析的搜索参数设置为:carbamidomethyl (C)为固定修饰，脱酰胺修饰(NQ)和氧化修饰(M)为可变修饰，10 ppm为肽质量耐受性，0.8 Da为MS/MS离子质量耐受性，2为遗漏切割余量。为了进行生物信息学分析，使用数据库注释，可视化和集成发现(DAVID)工具分析GO术语。根据p值≤0.05的一致性评分显著性阈值选择多肽。
从6个健康供体的pbmc中纯化的人原代NK细胞用于鉴定ADSC分泌组存在下NK细胞的基因表达模式。根据制造商的方案，使用RNeasy Micro试剂盒(QIAGEN)分离总RNA，然后送到Macrogen Inc. (Seoul, Republic of Korea)进行mRNA测序。使用2100生物分析仪(Agilent Technologies, Santa Clara, Ca, USA)检测提取的RNA的完整性，该仪器具有RNA完整性编号(RIN)值。使用TruSeq链mRNA文库试剂盒(Illumina, San Diego, CA, USA)制备RNA文库，根据制造商的协议，利用mRNA的多a选择。将纯化的RNA随机片段化，进行短读测序，合成cDNA。在合成的cDNA片段的两端添加不同的接头后，利用NovaSeq 6000平台(Illumina)进行PCR扩增，扩增量足以进行测序。RNA-seq原始读数使用FastQC v0.11.7程序(Babraham Institute, Cambridge, UK)进行质量控制(QC)，然后使用Trimmomatic v0.38进行修剪，以尽量减少在比对过程中可能发生的错误。修剪后，使用HISAT2 v2.1.0将RNA-seq reads映射到人类基因组群体，并使用StringTie v2.1.3b程序进行转录本组装，获得表达谱值。为了验证两组(对照组与实验组)的差异表达基因(DEGs)，使用DESeq2软件包将获得的基因水平reads计数归一化，最终选择352个满足|fc|≥双成对变化和nbinomWaldTest原始p值< 0.05条件的基因。这些基因通过分层聚类在热图和树状图上进行分组和可视化，火山图通过复合度量(log2fc ×?log10调整的p值)，点阵图通过GO富集。
每个实验独立重复三次以上，得到相似的结果。所有统计分析均使用GraphPad Prism 5或8软件(GraphPad software, San Diego, CA, USA)进行。数据用平均值±SEM表示。采用配对或非配对数据的双尾学生t检验来确定治疗值与控制值之间的统计学显著性。部分实验采用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett多重比较检验对对照组和各治疗组进行比较。统计学意义表示为:ns(无统计学意义)，*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001。
摘要。
背景
方法
结果
讨论
结论
数据和材料的可用性
缩写
参考文献。
致谢。
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